中大新闻网讯（通讯员李剑峰）真核生物基因组中广泛存在大量在染色体上串联排列的同源基因，称为tandemly arrayed genes或TAG。TAG在拟南芥、水稻、小麦、杨树、玉米基因组中占比约14~35%，在人和小鼠中占比约14~17%。TAG的功能研究需要同时解决基因功能冗余和染色体连锁两大难题，而CRISPR技术为TAG的功能研究提供了完美的工具。理论上，仅需使用一对gRNA分别靶向TAG的头和尾两个基因，则可将整段携带TAG的染色体删除，从而实现TAG的功能缺失。但值得注意的是，近年来在动植物中陆续发现CRISPR技术在染色体上产生的多个DNA双链断裂（DSB）会诱发染色体的异常变异，如重排、倒置等等。
近日，91免费无码国产在线播放生命科学学院李剑峰课题组在Nature Communications发表了题为“Hidden prevalence of deletion-inversion bi-alleles in CRISPR-mediated deletions of tandemly arrayed genes in plants”的研究论文，报道了在成对的gRNA引导下，CRISPR介导的TAG敲除会引发高频的染色体缺失/倒置双等位变异。该双等位突变体极易被传统基于三引物法的基因型鉴定PCR误判为纯合缺失突变体，继而会给后续的TAG功能研究埋下隐患。
作者首先为了研究拟南芥基因组中编码PEP细胞因子前体（PROPEP）的典型TAG功能，设计了成对的gRNA对串联的多个PROPEP基因进行CRISPR/Cas9敲除，并通过传统三引物法鉴定纯合缺失突变体。所谓三引物法是指先用分别结合于TAG两侧的一对相向引物进行第一次（tier-1）PCR，出现阳性的小分子量PCR条带则说明存在染色体删除；再用分别结合于TAG外侧及内部的一对相向引物进行第二次（tier-2）PCR，无PCR条带则说明缺失正常的TAG序列；两次PCR的结果可共同鉴定出纯合缺失突变体。然而，在对获得的“纯合缺失”突变体进行转录组分析时，作者意外发现位于TAG内部“已被删除”的PROPEP基因仍在表达。结合前述PCR结果与随后进行的TAIL-PCR和Sanger测序，最终发现一条染色体上的TAG已被删除，而另一条同源染色体上的TAG则在两个DSB位点之间发生了倒置，因而tier-2 PCR未能产生PCR条带，引起对基因型的误判。该突变体的子代中，缺失、倒置两种基因型的分离进一步确认了亲代的缺失/倒置双等位突变形式。基于deletion和inversion两个已有术语，该研究将此种新的双等位突变形式命名为delinver突变。
图1. 模式植物拟南芥中串联同源基因的CRISPR敲除诱发意外的敲除/倒置双等位突变体。a, 拟南芥的PROPEP基因家族是代表性的串联同源基因。b, CRISPR敲除PROPEP1-8所用的成对gRNA靶向示意图。c, PROPEP1在传统三引物法PCR鉴定的“敲除”突变体propep1-8 #2-4植株中仍存在表达。d, PROPEP1应答的抗病基因在“敲除”突变体propep1-8 #2-4中仍有正常应答。e,f, 新的PCR鉴定策略揭示propep1-8 #2-4突变体是敲除/倒置双等位突变体。
接下来，通过对拟南芥、水稻中多个不同的罢础骋进行成对驳搁狈础介导的颁搁滨厂笔搁/颁补蝉9敲除，在近2650个转基因植株或愈伤组织中，共有31对驳搁狈础成功产生大片段的罢础骋敲除，其中有27对驳搁狈础能够造成诲别濒颈苍惫别谤突变。比如，在对编码拟南芥狈尝搁免疫受体础罢5骋45240/础迟搁笔厂4/础迟搁搁厂1进行的12组罢础骋敲除中，某些成对驳搁狈础所诱导的罢础骋敲除突变体中有高达词80%实际上是诲别濒颈苍惫别谤突变体，12组的中位数为词51%。顿别濒颈苍惫别谤突变的发生与罢础骋所在的染色体位置、删除片段的大小均无显着相关性，但总体上与该对驳搁狈础所造成的罢础骋删除效率呈正相关性。此外，切割产生粘末端的颁搁滨厂笔搁/颁辫蹿1系统与切割产生平末端的颁搁滨厂笔搁/颁补蝉9系统一样，在植物原生质体细胞中也会诱导诲别濒颈苍惫别谤突变。进一步，作者发现成对驳搁狈础介导的颁搁滨厂笔搁敲除在植物基因组的非罢础骋位点（比如，罢础骋的相邻区域或者代谢基因簇）也会产生频率相似的诲别濒颈苍惫别谤突变。这些结果表明，成对驳搁狈础介导的颁搁滨厂笔搁敲除在植物基因组上诱导诲别濒颈苍惫别谤突变是一种普遍现象。为了防止诲别濒颈苍惫别谤突变体被误判为纯合缺失突变体进而误导罢础骋的功能研究，作者建议在罢础骋敲除突变体的基因型笔颁搁筛选时通过一对同向引物进行第叁次（迟颈别谤-3）笔颁搁，其阴性或阳性笔颁搁产物则可分别反映出该突变体是纯合缺失突变体还是诲别濒颈苍惫别谤突变体。
图2. 新的PCR鉴定策略能够区分串联同源基因的纯合敲除突变体与敲除/倒置双等位突变体。左图为串联同源基因（TAG）的CRISPR敲除策略示意图，图中展示了成对gRNA的靶点以及基因型鉴定所用PCR引物的靶点。右图为基因型鉴定PCR的结果与基因型之间的对应关系。四种基因型从左至右依次是野生型、杂合TAG敲除、纯化TAG敲除、TAG敲除/倒置双等位。加号和减号分别代表使用对应PCR引物获得或未获得PCR扩增产物。
91免费无码国产在线播放博士生刘玖尔和副研究员王凤珠为该论文的共同第一作者，李剑峰教授为通讯作者。博士生李冲、博士后李雨佳参与了该研究。该研究得到国家重点研发计划合成生物学专项等经费资助。
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